1. 연구의 필요성

혈관성 치매(vascular dementia [VaD])는 혈관의 폐색이나 혈관질환으로 발생한 만성 대뇌 저관류(chronic cerebral hypoperfusion)로 인하여 뇌의 혈류량이 감소하면서 점진적으로 기억력의 저하, 문제해결능력의 감퇴 및 사고 장애 등의 증상이 나타나는 질환으로 전체 치매 중 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease [AD]) 다음으로 가장 큰 비율을 차지하고 있다[1]. VaD를 일으키는 병리적 기전은 아직 명확히 밝혀지지 않았으나, AD와는 달리 만성 대뇌 저관류로 유도된 저산소증으로 인하여 산화 스트레스, 염증, 혈관 및 혈액-뇌 장벽의 손상이 동반된다고 알려져 있다[2]. 현재까지의 연구 결과를 살펴보면 저산소증으로 유발된 산화 스트레스는 미토콘드리아의 기능 이상을 유발하며, 체내의 활성산소를 증가시켜서 혈관과 신경세포에 손상을 일으킨다[3]. 혈류 감소로 인한 저산소증은 또한 미세혈관의 형태 및 기능 이상을 일으켜 내피세포의 기능 장애, 혈액-뇌 장벽의 붕괴 및 염증을 유발한다[4]. 이 때 혈액-뇌 장벽의 붕괴 시 방출되는 염증 인자들에 의하여 백색질에서 말이집탈락, 축삭소실, 희소돌기아교세포의 퇴행이 나타난다[5]. 염증으로 인하여 미세아교세포가 활성화되고[6], 투과도가 커진 혈액-뇌 장벽을 통하여 인터루킨 1, 인터루킨 6과 같은 염증 유발인자가 침투하여 백색질의 손상을 더욱 악화시킨다[5]. 이로 인해 해마에서 신경재생, 시냅스 가소성, 가지돌기(dendrite) 밀도가 감소되고 백색질의 손상이 나타나 기억 손상이 유발된다[7]. 주로 이러한 손상은 대뇌겉질(cerebral cortex), 해마(hippocampus), 백색질(white matter)에서 나타나며 기억 손상, 기분 장애, 문제해결, 수행기능의 상실과 같은 증상들을 유발시킨다[1].

VaD의 임상적 유형은 다발경색 치매(multi-infarct dementia), 겉질밑 치매(subcortical dementia), 혼합형 치매(mixed dementia), 겉질밑 경색과 백색질 뇌증을 동반한 보통염색체우성뇌혈관병변(cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy [CADASIL])등이 있다[8]. 이와 같이 VaD는 다양한 임상적 특성을 나타내기 때문에 질병 발생기전의 이해 및 치료제 개발을 위하여 다양한 동물 모델이 개발되어 연구가 진행되고 있다. 대표적인 VaD 모델은 양측 온목동맥 폐색(bilateral common carotid artery occlusion [BCCAO])모델이다. BCCAO 모델은 양측 온목동맥을 영구적으로 결찰하여 만성 대뇌 저관류를 유도하며, 대뇌겉질 및 해마의 손상, 백색질의 말이집탈락, 미세혈관 기능 이상 등 사람의 VaD와 유사한 병태생리를 나타내기 때문에 동물 모델 중에서 가장 널리 사용되고 있다[9].

현재 VaD의 예방을 위하여 항고지혈증제, 항고혈압제, 항혈소판제 등 뇌혈관질환을 예방할 수 있는 약물들이 효과가 있다고 알려져 있다[8]. 치료 약물은 AD의 치료에 사용되는 N-메틸-D 아스파르트산염(N-methyl-D-aspartate [NMDA]) 수용체 길항제인 memantine과 아세틸콜린에스테라아제 억제제인 galantamine, donepezil, rivastigmine 등의 약물이 효과가 있다고 보고되었으나 VaD 치료 목적으로 Food and Drug Administration (FDA) 승인을 받은 약물은 없다[10]. 또한 비약물적 중재 대부분의 연구가 AD 환자들을 대상으로 인지기능 증진 및 행동심리증상 감소를 위하여 연구들이 진행되었으며, 인지 훈련, 인지 자극, 신체 운동, 음악 요법, 회상 요법이 기억 능력을 향상하는데 효과가 있는 것으로 확인되었다[11]. 따라서 VaD에 대한 연구가 매우 부족한 실정으로 치매 대상자의 손상된 인지기능을 회복시키기 위하여 AD뿐만 아니라 VaD의 병태생리에 대한 정확한 이해와 치료약물 및 중재의 개발도 꼭 필요하다.

최근 들어, 그렐린(ghrelin)이 학습과 기억에 효과가 있다는 연구 결과가 보고되고 있다[12]. 그렐린은 위 기저부, 시상하부, 해마, 대뇌겉질 등에서 배고픔을 느낄 때 분비되는 호르몬으로 성장호르몬 분비촉진인자 수용체(growth hormone secretagogue receptor [GHS-R])와 결합한다[13]. 그렐린은 28개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 1999년에 Kojima 및 그의 동료들이 처음 발견한 이후로 뇌하수체 성장호르몬의 분비 자극, 식욕, 대사, 위산 분비 증진 및 위 운동 증진, 평균 동맥압 감소 등 다양한 기능을 가지고 있다고 알려져 왔다[14]. 그렐린은 주로 뇌하수체로부터 성장호르몬의 분비를 촉진하고, 시상하부의 활꼴핵(arcuate nucleus)에 있는 신경펩티드 Y (neuropeptide Y)/아구티관련펩티드(agouti-related peptide)를 주로 발현하는 신경세포를 활성화시켜 배고픔을 느끼게 하여 음식물 섭취를 유도하는 역할을 한다[13].

식욕 조절 기능 이외에도 그렐린은 해마의 가지돌기에서 새로운 가지의 생성을 증가시켜서 시냅스에서 일어나는 신경전달을 증진시키는 시냅스 가소성 및 해마의 치아이랑(dentate gyrus) 부위에서 일어나는 신경 재생을 통하여 학습과 기억 능력을 증진시킨다[15, 16]. 이러한 기능은 다양한 선행연구를 통해 확인되었다[16, 17, 18, 19]. 신경퇴행성 질환인 AD모델에서 그렐린 투여 후 대뇌의 염증과 신경세포 소실이 감소되어 신경 보호 효과가 있음을 확인하였고[15], 허혈성 뇌질환 모델에서도 대뇌겉질 및 해마의 신경세포 소실을 감소시키는 것으로 관찰되어 그렐린이 신경퇴행성 질환 및 허혈성 질환에서 신경 보호의 역할을 한다고 보고되었다[20]. 또한 세포수준의 연구에서도 허혈성 심장질환 모델에서 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor [VEGF]), 혈관내피성장인자수용체2 (vascular endothelial growth factor receptor 2 [VEGFR2]), 혈관내피산화질소합성효소(endothelial nitric oxide synthase)를 증가시켜 새로운 혈관이 생성되는 혈관 신생(angiogenesis) 작용을 유도하였다[21]. 이외에 외상성 뇌 손상에서 백색질의 별아교세포(astorcyte)를 감소시켜 염증반응을 경감시켰다[22]. 따라서 선행연구들을 바탕으로 VaD에서 그렐린의 투여가 백색질 및 해마의 손상을 감소시키고 혈관신생을 통한 학습과 기억을 증진시키는 중재로서의 가능성을 검토하고자 한다. 그렐린으로 인해 해마에서 혈관신생이 유도된다면 충분한 혈액 공급으로 인하여 시냅스 가소성과 신경재생이 더욱 활발하게 일어나 기억 증진 효과가 있을 것이며, 또한 그렐린이 백색질의 말이집탈락(demyelination)을 감소시킨다면 기억을 포함한 뇌의 통합기능 향상에 효과가 있을 것이다.

이에 본 연구는 그렐린이 BCCAO로 유발된 VaD 쥐의 기억 손상에 미치는 효과를 행동학적, 분자생물학적 방법을 통해 확인하여 중재 개발을 위한 기초 자료로 활용하고자 하였다.

2. 연구 목적

본 연구의 목적은 VaD 쥐에게 그렐린을 4주간 복강 내 투여한 후 기억 손상에 미치는 효과를 행동학적, 분자생물학적으로 파악하기 위함이다.

3. 연구 가설

1. 연구 설계

본 연구는 BCCAO로 유발된 VaD 쥐에게 그렐린을 투여한 후 기억 손상에 미치는 효과를 규명하기 위한 무작위 대조군 사후설계이다.

2. 연구 대상

실험동물은 11주령의 수컷 Wistar 쥐를 공급받아 무작위화 프로그램(an online random number generator, www.randomizer.or)을 이용하여 모의 대조군(sham, n=7), 양측 온목동맥 폐색군(VaD, n=6), 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군(VaD+ghrelin, n=7)으로 무작위 배정하였다. 본 연구의 표본 수는 사전 연구 또는 선행 연구가 거의 없으므로 효과크기를 산정하기 어렵고, 검정력 분석 방법(power analysis)으로 산정하기 어려우므로 표준편차 및 효과 크기에 대한 정보가 없을 때 총 분산을 이용한 오차 추정 방법을 이용한 표본 수 산정 방법인 자원 방정식(resource equation) 방법을 이용하여 계산하였다[23]. 오차 자유도(error degrees of freedom)가 10 이하일 경우에는 결과 값에 영향을 줄 수 있고, 20 이상일 경우 쥐의 숫자가 증가해도 결과 값에 크게 영향을 미치지 않으므로 동물 보호를 위하여 오차 자유도 10~20사이로 유지하는 것이 적절하다. 오차 자유도는 총 마리 수의 자유도에서 실험 간 자유도(treatment degree of freedom)를 빼서 계산한다. 오차 자유도 값이 18로 적정하게 측정되기 위하여 각 그룹 당 7마리씩의 쥐가 필요하다. 따라서 양측 온목동맥 폐색으로 인한 사망률이 20% 내외로 알려진 것을 고려하여 각 군 당 9마리씩 총 27마리를 연구에 사용하였으나, 수술 후 모의 대조군에서 2마리, 양측 온목동맥 폐색군에서 3마리, 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군에서 2마리가 사망하여 총 7마리를 제외한 20마리로 실험을 진행하였다(Figure 1). 실험기간 동안 평균 온도 23±2℃, 습도 50±2%로 유지하며, 밤낮 주기(12시간 light/12시간 dark, light turn on 6 am)가 조절되는 환경에 수용하면서 실험기간동안 물과 고형 사료는 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.

Figure 1
Flow of the study.

• Download Figure

3. 윤리적 고려

본 연구는 K대학교 동물실험윤리위원회의 승인(승인번호: KHUASP(SE)-16-046)을 받은 후 규정에 따라 실행하였다. 본 연구자는 실험동물 복지 및 윤리 교육과정을 이수하였으며, 동물 다루기, 마취제 투여, 통증 감소를 위한 교육을 받았다. 또한 실험동물의 3R원칙인 실험동물의 대체(replacement), 실험동물 수의 감소(reduction), 동물실험의 세련화(refinement)에 따라 동물 실험 방법을 준수하였다. 약물 투여가 중재로 사용되는 실험이기 때문에 쥐를 대상으로 한 실험 방법이 필요하였고, 동물 수를 감소시키기 위하여 자원 방정식 방법을 사용하여 실험에 참여하는 동물의 수를 최소화 하였다. 또한 수술 후 회복 기간을 포함한 실험 기간 동안 동물을 청결하고 따뜻한 환경에서 사육할 수 있도록 노력하였다.

4. 실험 방법

1. 가설검정

1) 가설1

Y-미로를 통한 쥐의 공간 작업 기억능력을 측정한 교대율은 모의 대조군(70.57%)과 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군(72.14%)이 양측 온목동맥 폐색군(57.17%) 보다 높았다(p<.001).

수중 미로를 통한 쥐의 공간 학습과 기억 능력을 측정한 프로브 검사의 결과도 모의 대조군(4.00회)과 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군(2.93회)이 양측 온목동맥 폐색군(1.96회)보다 높아서(p<.001) 가설1은 지지되었다(Table 1).

Table 1
Results of the Behavior Test

• Download Table

2) 가설2

백색질의 대표적인 부위인 뇌량(corpus callosum) A, B, C 영역을 측정한 두께의 평균은 모의 대조군(94.60 µm), 양측 온목동맥 폐색군(86.80 µm), 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군(94.45 µm)간에 차이가 있었는데(p=.009), 추가 분석한 결과 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군은 양측 온목동맥 폐색군보다 유의하게 높아(p=.017) 가설 2의 부가설 1은 지지되었다(Figure 2C).

Figure 2
Results of the immunohistochemistry analysis. (A) Staining by NeuN in the hippocampus. (B) Staining by RECA-1 in the hippocampus. (C) Photomicrographs of callosal thickness in the corpus callosum. (D) Staining by MBP in the corpus callosum. (E) Double immunofluorescence staining for VEGF and RECA-1 demonstrates their localization in the hippocampus. Scale bar represents 100 µm. ^*means p<.05 when compared to the VaD group.

• Download Figure

뇌량에서 신경의 수초화에 중요한 역할을 하는 단백질인 MBP를 이용하여 염색된 말이집의 상대적인 광학밀도 비율(relative optical density ratio)은 모의 대조군(0.18), 양측 온목동맥 폐색군(0.12), 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군(0.17)간에 차이가 있었는데(p=.016), 추가 분석한 결과 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군은 양측 온목동맥 폐색군보다 유의하게 높아(p=.034) 가설 2의 부가설 2는 지지되었다(Figure 2D).

4) 가설4

해마의 혈관 신생에 중요한 역할을 하는 VEGF 단백질 발현의 상대적인 광학밀도 비율(relative optical density ratio)은 모의 대조군(0.39), 양측 온목동맥 폐색군(0.52), 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군(1.44)간에 유의한 차이가 있었는데(p=.008), 추가 분석한 결과 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군은 양측 온목동맥 폐색군보다 광학 밀도가 유의하게 높아(p=.022) 가설 4의 부가설 1은 지지되었다(Figure 3A, B).

Figure 3
Result of western blot analysis. (A) Western blot analysis of VEGF, VEGFR2, and pAKT. (B) Expression level of VEGF in the hippocampus. (C) Expression level of VEGFR2 in the hippocampus. (D) Expression level of pAKT in the hippocampus. ^*means p<.05 when compared to the VaD group.

• Download Figure

VEGFR2의 상대적인 광학밀도 비율(relative optical density ratio)은 모의 대조군(1.01), 양측 온목동맥 폐색군(1.74), 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군(2.40)간에 유의한 차이가 있었으나(p=.006), 추가 분석한 결과 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군은 양측 온목동맥 폐색군보다 유의하게 높지 않아(p=.122) 가설 4의 부가설 2는 기각되었다(Figure 3A, C).

해마에서 발현된 VEGFR2가 미세 혈관에 작용하여 혈관신생을 유도하기 위해서는 VEGFR2가 혈관 위에 공존(colocalization)해야 한다. Figure 2E의 병합(merge)한 사진에서 RECA-1에 의해 염색된 미세혈관 위에 VEGFR2가 존재하는 것을 확인하였다. Phospho-Akt의 상대적인 광학밀도 비율(relative optical density ratio)은 모의 대조군(0.72), 양측 온목동맥 폐색군(1.49), 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군(2.78)간에 유의한 차이가 있었는데(p<.001), 추가 분석한 결과 양측 온목동맥 폐색 및 그렐린 투여군은 양측 온목동맥 폐색군보다 유의하게 높아(p=.012) 가설 4의 부가설 3은 지지되었다(Figure 3A, D).